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動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

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動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)

教學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)

專業(yè)動(dòng)物檢疫年級(jí)班級(jí)

姓名學(xué)號(hào)

指導(dǎo)教師趙宇軍職稱副教授

動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

實(shí)習(xí)時(shí)間:201*年5月8日至8月13日

實(shí)習(xí)地點(diǎn):山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)老師:趙宇軍

實(shí)習(xí)內(nèi)容:時(shí)間過(guò)的很快,轉(zhuǎn)眼間三年的大學(xué)生活就結(jié)束了,我們動(dòng)物檢疫專業(yè)的同學(xué)從五月份開(kāi)始了為期3個(gè)多月的教學(xué)實(shí)習(xí),在眾多輔導(dǎo)老師之中,我有幸跟隨我校動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系的趙宇軍教授進(jìn)行學(xué)習(xí)。實(shí)習(xí)地點(diǎn)為我校獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)習(xí)內(nèi)容自行選擇。在老師的帶領(lǐng)下我進(jìn)行了大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和食物中金黃葡萄球菌的檢驗(yàn)。下面我們來(lái)回顧這次實(shí)驗(yàn)。

大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

一、培養(yǎng)基配置

我們一般用LB液體培養(yǎng)基來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌,培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基配置步驟:

1.稱量:準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g,酵母提取物0.25g,氯化鈉0.5g,加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加1g瓊脂。

2.溶化:加熱熔化,用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂,整個(gè)過(guò)程不斷用玻棒攪拌,目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。3.調(diào)pH:用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。

4.滅菌:在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基,加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好,放入滅菌鍋內(nèi),1kg壓力滅菌15min。5.倒平板:滅菌后,待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過(guò)程是:①將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁,右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶,左手拔出棉塞;②右手拿三角瓶,使三角瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰;③用左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于三角瓶口的縫隙,右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,立刻蓋上皿蓋;④待平板冷卻凝固后,將平板倒過(guò)來(lái)放置。二、滅菌和消毒1.無(wú)菌技術(shù):①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒;②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌;③為避免周?chē)⑸镂廴荆瑢?shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行;④避免已滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲废嘟佑|。2.消毒方法:①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法;②對(duì)一些不耐高溫的液體,則使用巴氏消毒法;③對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果,然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒;④實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。3.滅菌方法:①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法;②培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法,所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋;③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法,所用器械是紫外燈。三、細(xì)菌的分離

采用劃線分離法,其操作步驟是:將培養(yǎng)皿底部用拇指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài),在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi)。在此同時(shí),用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液,迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi),在平板培養(yǎng)基的一邊,作第1次平行劃線3~5條,轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角,用燒過(guò)冷卻的接種針,通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線,然后再用同樣方法,通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時(shí),接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣,也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后,蓋上皿蓋,倒置于恒溫箱培養(yǎng)。

四、菌落和菌種種類(lèi)的辨認(rèn)細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤(rùn)的,有黏稠性,多數(shù)透明或半透明,但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的;放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子,所以菌落表面是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺,長(zhǎng)孢子后就成粉末狀,由于菌絲和孢子有多種色素,所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色,菌落不易用接種環(huán)挑動(dòng);酵母菌落類(lèi)似于細(xì)菌菌落,表面光滑而濕潤(rùn),有黏稠性但大多呈乳白色,少數(shù)呈紅色。

食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法

金黃色葡萄球菌是一種引起人類(lèi)和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌,也是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界,如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類(lèi)和動(dòng)物的皮膚及外界相通的腔道中,也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報(bào)導(dǎo),在正常人群中的帶菌率可達(dá)30%~80%,其中皮膚帶菌率為8~22%,鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在40~50%以上,因此其可通過(guò)各種途徑和方式,尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素,故一旦細(xì)菌污染食品,并在合適的溫度環(huán)境下,細(xì)菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素,從而引起消費(fèi)者食物中毒。

我國(guó)對(duì)金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB.4789-10-84及檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN.0172-92作為依據(jù)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程獲得最終結(jié)果須時(shí)5天左右,既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力,并造成貨物積壓,也影響貨物的及時(shí)出運(yùn),并使貨主的倉(cāng)儲(chǔ)成本提高,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

多年來(lái)很多食品微生物實(shí)驗(yàn)室都在探索和尋找一些準(zhǔn)確性高,并快速的檢測(cè)方法,最近我們分別從美國(guó)3M公司和法國(guó)生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基,其名稱為:①PetrifilmRSA.CountPlate(由美國(guó)3M公司研制生產(chǎn)),是一種薄膜型快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)平板。②Baird-parker+RPFAgar.(由法國(guó)生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)平板)。一、實(shí)驗(yàn)原理

Petrifilm.RSA.測(cè)試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片,此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker,營(yíng)養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質(zhì)。第二部分是一種耐熱核酸酶(TNase)反應(yīng)片,含有DNA及甲苯胺蘭(ToluidineBlue-O)及四唑指示劑(Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計(jì)數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。

耐熱去氧核糖核酸(deoxyribonulcasDnase)為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征,此酶非常耐熱,在100℃加熱30min,不易喪失活性,在130℃之下,其D值為16.6min,此酶之分子量為16800,等電點(diǎn)PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測(cè)血漿凝固酶相似,是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法,在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上,耐熱DNA酶反應(yīng)看起來(lái),呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個(gè)紅色或蘭色的菌落。

Petrifilm.RSA檢測(cè)片,必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應(yīng)片一起使用,單獨(dú)使用將不會(huì)顯示菌落,因?yàn)榫哂休o助計(jì)數(shù)菌落的指示劑是在反應(yīng)片上,而不是在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上。

Baird-parker+RPFagar,這一培養(yǎng)基中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀,使菌落顏色呈黑色,RPF補(bǔ)充有兔血漿和牛纖維蛋白原,以便檢測(cè)凝固酶活力,胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽(yáng)性菌落周?chē)恋頃灜h(huán)纖維蛋白的溶解,因此凡存在血漿凝固酶陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌,將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落,即可確認(rèn),并作計(jì)數(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟材料和方法:

本次實(shí)驗(yàn)采用以下3種試劑:

1.美國(guó)3M公司提供的Petrifilm.Rapid.S.aureusCountPlate.2.法國(guó)生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker+RPFagar.

3.實(shí)驗(yàn)室自配Baird-Park瓊脂(英國(guó)Oxoid)及新鮮兔血漿。

菌種來(lái)自美國(guó)菌種保存中心(AmericaTyPCultureCollection)。金黃色葡萄球菌共10株菌株,其菌號(hào)分別為:

ATCC27661ATCC27664ATCC13565ATCC51704

ATCC(K)12600ATCC(R)65389ATCC25923ATCC29213ATCC8095ATCC12598

非金黃色葡萄球菌菌種5株,其菌號(hào)分別為:ATCC51813(大腸桿菌)、ATCC624(無(wú)乳鏈球菌)、ATCC51816(陰溝腸桿菌)、ATCC6051(枯草桿菌)、ATCC49214(腸炎沙門(mén)氏菌)、自然食品檢樣,任意購(gòu)自市場(chǎng)。本次實(shí)驗(yàn)是以同一測(cè)試樣品經(jīng)均質(zhì)并通過(guò)無(wú)菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個(gè)稀釋度同時(shí)接種上述三種培養(yǎng)基作平行實(shí)驗(yàn),在取得最終結(jié)果后相互進(jìn)行比對(duì)。

上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說(shuō)明進(jìn)行操作,另外Baird-ParkerAgar培養(yǎng)基是按SN0172-92標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。

A、本次實(shí)驗(yàn)共測(cè)試已知標(biāo)準(zhǔn)菌種共15株,其中葡萄球菌10株,其他菌種5株(包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、枯草桿菌和無(wú)乳鏈球菌)。

B、測(cè)試自然食品檢樣共101只(其中包括肉11只、肉類(lèi)14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

A、被檢菌種10株,金黃色葡萄球菌在三種培養(yǎng)基上都能檢出生長(zhǎng)情況良好,同一稀釋度的菌液,除個(gè)別菌株外在3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果基本都在一個(gè)數(shù)量級(jí)上,無(wú)顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長(zhǎng)。

B、自然食品檢樣共接種101只,每一檢樣同一稀釋濃度分別同時(shí)種三種培養(yǎng)基,最終共檢出金黃色葡萄球菌45只,占全部檢樣的44.5%,其中PetrifilmRSA檢出陽(yáng)性結(jié)果為42只,占全部陽(yáng)性檢樣的93.3%,Baird-Parker+RPFAgar.檢出陽(yáng)性結(jié)果26只,占全部陽(yáng)性檢樣的57.7%。Baird-Parker.Agar檢出陽(yáng)性結(jié)果32只,占全部陽(yáng)性檢樣的71.1%。四、實(shí)驗(yàn)討論

1.用15株標(biāo)準(zhǔn)菌在3種培養(yǎng)基中的檢測(cè),10株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種,結(jié)果生長(zhǎng)良好,其最終計(jì)數(shù)基本一致,定位在同一數(shù)量級(jí),5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長(zhǎng),說(shuō)明上述三種培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌選擇良好。

2.以101只自然樣品同一均質(zhì)稀釋液,同時(shí)接種三種培養(yǎng)基,從最終結(jié)果來(lái)看,對(duì)金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性檢出率為44.5%

3.從檢測(cè)程序來(lái)年,Petrifilm.RSA及Baird-Parker+RPF.Agar.都在樣品接種后28~30h觀察結(jié)果,并不必再做證實(shí)試驗(yàn),而如以Baird-ParkerAgar檢測(cè),須在接種后48h觀察平板,并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中,在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí),最終計(jì)數(shù),前后約須80h。4.從本次試驗(yàn)中觀察,使用上述三種培養(yǎng)基對(duì)食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計(jì)數(shù)檢測(cè),其樣品接種液的含量擬控制在100個(gè)/ml以內(nèi),比較容易分清并計(jì)數(shù),如菌量過(guò)濃,則將會(huì)影響最后的讀數(shù),因此對(duì)新送的被檢樣品,如在不了解污染的情況下一般必須要做2個(gè)以上的稀釋度,同時(shí)分別接種,才能獲得較為滿意的結(jié)果。

而在Baird-Parker+RPFAgar及Baird-Parker.Agar接種時(shí)必須將1ml樣液作三只平板涂布(0.3、0.3、0.4ml)這樣就會(huì)造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大,但Baird-Parker.RPF.培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng),并作計(jì)數(shù)。5.在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn),按使用說(shuō)明對(duì)Petrifilm.RSA.及Barid-Parker+RPF.Agar,操作規(guī)定在接種24h后觀察結(jié)果,此時(shí)往往由于菌落長(zhǎng)得經(jīng)較小,特征瓜不明顯,但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯,并可能會(huì)經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加,這樣可以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。

6.由于對(duì)上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應(yīng)商的報(bào)價(jià),故無(wú)法測(cè)算每一樣品的測(cè)試成本價(jià)格。但可以予計(jì)上述兩面種快速檢測(cè)培養(yǎng)基的耗材費(fèi)用要高于常規(guī)經(jīng)典方法(Baird-ParkerAgar)的費(fèi)用。7.通過(guò)本次實(shí)驗(yàn),我們感到使用美國(guó)3M公司生產(chǎn)的Petrifilm.RSAPlate培養(yǎng)基和法國(guó)生物-梅利埃公司生產(chǎn)的Baird-ParkerRPF.Agar培養(yǎng)基檢測(cè)中的金黃色葡萄球菌?梢员饶壳俺R(guī)檢測(cè)方法時(shí)間可縮短一半。并可以明顯節(jié)省大量人力。這完全符合實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)的要求,尤其是對(duì)基層較簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室條件中,更顯其使用方便的優(yōu)越性。

實(shí)習(xí)總結(jié):通過(guò)這次嚴(yán)謹(jǐn)而有序的實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí),為我們先前在教學(xué)中學(xué)習(xí)到的知識(shí)提供了一個(gè)實(shí)際的操作實(shí)施平臺(tái),也為今后在這方面檢驗(yàn)技術(shù)的工作起到了指引作用。在過(guò)去的學(xué)習(xí)中,我們并不了解具體的病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)的具體流程,注意事項(xiàng)等等非常關(guān)鍵和必須的防御手段。通過(guò)此次生產(chǎn)實(shí)習(xí),使我們對(duì)以前所不熟知的問(wèn)題有了深入的認(rèn)識(shí),也對(duì)目前的情況有所思考和感悟。在我看來(lái),動(dòng)物檢疫人員在我國(guó)國(guó)民生活中起到了關(guān)鍵作用,民以食為天,沒(méi)有認(rèn)真負(fù)責(zé)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè),將給社會(huì)帶來(lái)巨大的飲食災(zāi)難,為此,我感到非常自豪和驕傲。在今后的工作學(xué)習(xí)中,我將一如既往的認(rèn)真下去,無(wú)愧自己的職責(zé)和稱號(hào)。

在此感謝我院的各級(jí)領(lǐng)導(dǎo),特別是我的指導(dǎo)老師趙宇軍教授。

擴(kuò)展閱讀:病原微生物檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

病原微生物檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

大三下學(xué)期5月份,我們動(dòng)物檢疫專業(yè)的同學(xué)開(kāi)始了為期2個(gè)多月的教學(xué)實(shí)習(xí),在眾多輔導(dǎo)老師之中,我有幸跟隨我校動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系的趙宇軍教授進(jìn)行學(xué)習(xí)。實(shí)習(xí)的地點(diǎn)就在我校動(dòng)科樓的微生物實(shí)驗(yàn)室,以前我們?cè)谶@里上過(guò)實(shí)驗(yàn)課,所以并不陌生。這次大家來(lái)到實(shí)驗(yàn)室為自行選擇課題進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作,我對(duì)世界聞名的金黃色葡萄球菌非常感興趣,在老師的帶領(lǐng)下進(jìn)行了相關(guān)食物中該菌的檢驗(yàn)。下面我們來(lái)回顧這次實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法

金黃色葡萄球菌是一種引起人類(lèi)和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌,也是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界,如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類(lèi)和動(dòng)物的皮膚及外界相通的腔道中,也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報(bào)導(dǎo),在正常人群中的帶菌率可達(dá)30%~80%,其中皮膚帶菌率為8~22%,鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在40~50%以上,因此其可通過(guò)各種途徑和方式,尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素,故一旦細(xì)菌污染食品,并在合適的溫度環(huán)境下,細(xì)菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素,從而引起消費(fèi)者食物中毒。

由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒,在世界各國(guó)都極為普遍。特別是在北美及歐洲等地區(qū)發(fā)病率更高。在上述這些國(guó)家中,每年有金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例,僅次于沙門(mén)氏菌,而在細(xì)菌性食物中毒病例排到第2~3位,有此而造成的經(jīng)濟(jì)損失也相當(dāng)慘重,在我國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例也時(shí)有報(bào)導(dǎo),所以目前世界各國(guó)都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測(cè)項(xiàng)目。

我國(guó)對(duì)金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB.4789-10-84及檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN.0172-92作為依據(jù)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程獲得最終結(jié)果須時(shí)5天左右,既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力,并造成貨物積壓,也影響貨物的及時(shí)出運(yùn),并使貨主的倉(cāng)儲(chǔ)成本提高,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。多年來(lái)很多食品微生物實(shí)驗(yàn)室都在探索和尋找一些準(zhǔn)確性高,并快速的檢測(cè)方法,最近我們分別從美國(guó)3M公司和法國(guó)生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基,其名稱為:

①PetrifilmRSA.CountPlate(由美國(guó)3M公司研制生產(chǎn)),是一種薄膜型快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)平板。

②Baird-parker+RPFAgar.(由法國(guó)生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)平板)。

二、實(shí)驗(yàn)原理:

Petrifilm.RSA.測(cè)試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片,此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker,營(yíng)養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質(zhì)。第二部分是一種耐熱核酸酶(TNase)反應(yīng)片,含有DNA及甲苯胺蘭(ToluidineBlue-O)及四唑指示劑(Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計(jì)數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。

耐熱去氧核糖核酸(deoxyribonulcasDnase)為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征,此酶非常耐熱,在100℃加熱30min,不易喪失活性,在130℃之下,其D值為16.6min,此酶之分子量為16800,等電點(diǎn)PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測(cè)血漿凝固酶相似,是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法,在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上,耐熱DNA酶反應(yīng)看起來(lái),呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個(gè)紅色或蘭色的菌落。

Petrifilm.RSA檢測(cè)片,必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應(yīng)片一起使用,單獨(dú)使用將不會(huì)顯示菌落,因?yàn)榫哂休o助計(jì)數(shù)菌落的指示劑是在反應(yīng)片上,而不是在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上。

Baird-parker+RPFagar,這一培養(yǎng)基中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀,使菌落顏色呈黑色,RPF補(bǔ)充有兔血漿和牛纖維蛋白原,以便檢測(cè)凝固酶活力,胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽(yáng)性菌落周?chē)恋頃灜h(huán)纖維蛋白的溶解,因此凡存在血漿凝固酶陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌,將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落,即可確認(rèn),并作計(jì)數(shù)。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

材料和方法:

本次實(shí)驗(yàn)采用以下3種試劑:

1.美國(guó)3M公司提供的Petrifilm.Rapid.S.aureusCountPlate.2.法國(guó)生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker+RPFagar.3.實(shí)驗(yàn)室自配Baird-Park瓊脂(英國(guó)Oxoid)及新鮮兔血漿。

菌種來(lái)自美國(guó)菌種保存中心(AmericaTyPCultureCollection)。金黃色葡萄球菌共10株菌株,其菌號(hào)分別為:

ATCC27661ATCC27664ATCC13565ATCC51704ATCC(K)12600ATCC(R)65389ATCC25923ATCC29213ATCC8095ATCC12598

非金黃色葡萄球菌菌種5株,其菌號(hào)分別為:

ATCC51813(大腸桿菌)、ATCC624(無(wú)乳鏈球菌)、ATCC51816(陰溝腸桿菌)、ATCC6051(枯草桿菌)、ATCC49214(腸炎沙門(mén)氏菌)、自然食品檢樣,任意購(gòu)自市場(chǎng)。本次實(shí)驗(yàn)是以同一測(cè)試樣品經(jīng)均質(zhì)并通過(guò)無(wú)菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個(gè)稀釋度同時(shí)接種上述三種培養(yǎng)基作平行實(shí)驗(yàn),在取得最終結(jié)果后相互進(jìn)行比對(duì)。

上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說(shuō)明進(jìn)行操作,另外Baird-ParkerAgar培養(yǎng)基是按SN0172-92標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。

A、本次實(shí)驗(yàn)共測(cè)試已知標(biāo)準(zhǔn)菌種共15株,其中葡萄球菌10株,其他菌種5株(包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、枯草桿菌和無(wú)乳鏈球菌)。B、測(cè)試自然食品檢樣共101只(其中包括肉11只、肉類(lèi)14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只)。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

A、被檢菌種10株,金黃色葡萄球菌在三種培養(yǎng)基上都能檢出生長(zhǎng)情況良好,同一稀釋度的菌液,除個(gè)別菌株外在3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果基本都在一個(gè)數(shù)量級(jí)上,無(wú)顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長(zhǎng)。

B、自然食品檢樣共接種101只,每一檢樣同一稀釋濃度分別同時(shí)種三種培養(yǎng)基,最終共檢出金黃色葡萄球菌45只,占全部檢樣的44.5%,其中PetrifilmRSA檢出陽(yáng)性結(jié)果為42只,占全部陽(yáng)性檢樣的93.3%,Baird-Parker+RPFAgar.檢出陽(yáng)性結(jié)果26只,占全部陽(yáng)性檢樣的57.7%。Baird-Parker.Agar檢出陽(yáng)性結(jié)果32只,占全部陽(yáng)性檢樣的71.1%。

五、實(shí)驗(yàn)討論

1.用15株標(biāo)準(zhǔn)菌在3種培養(yǎng)基中的檢測(cè),10株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種,結(jié)果生長(zhǎng)良好,其最終計(jì)數(shù)基本一致,定位在同一數(shù)量級(jí),5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長(zhǎng),說(shuō)明上述三種培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌選擇良好。

2.以101只自然樣品同一均質(zhì)稀釋液,同時(shí)接種三種培養(yǎng)基,從最終結(jié)果來(lái)看,對(duì)金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性檢出率為44.5%

3.從檢測(cè)程序來(lái)年,Petrifilm.RSA及Baird-Parker+RPF.Agar.都在樣品接種后28~30h觀察結(jié)果,并不必再做證實(shí)試驗(yàn),而如以Baird-ParkerAgar檢測(cè),須在接種后48h觀察平板,并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中,在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí),最終計(jì)數(shù),前后約須80h。

4.從本次試驗(yàn)中觀察,使用上述三種培養(yǎng)基對(duì)食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計(jì)數(shù)檢測(cè),其樣品接種液的含量擬控制在100個(gè)/ml以內(nèi),比較容易分清并計(jì)數(shù),如菌量過(guò)濃,則將會(huì)影響最后的讀數(shù),因此對(duì)新送的被檢樣品,如在不了解污染的情況下一般必須要做2個(gè)以上的稀釋度,同時(shí)分別接種,才能獲得較為滿意的結(jié)果。

而在Baird-Parker+RPFAgar及Baird-Parker.Agar接種時(shí)必須將1ml樣液作三只平板涂布(0.3、0.3、0.4ml)這樣就會(huì)造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大,但Baird-Parker.RPF.培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng),并作計(jì)數(shù)。

5.在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn),按使用說(shuō)明對(duì)Petrifilm.RSA.及Barid-Parker+RPF.Agar,操作規(guī)定在接種24h后觀察結(jié)果,此時(shí)往往由于菌落長(zhǎng)得經(jīng)較小,特征瓜不明顯,但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯,并可能會(huì)經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加,這樣可以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。

6.由于對(duì)上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應(yīng)商的報(bào)價(jià),故無(wú)法測(cè)算每一樣品的測(cè)試成本價(jià)格。但可以予計(jì)上述兩面種快速檢測(cè)培養(yǎng)基的耗材費(fèi)用要高于常規(guī)經(jīng)典方法(Baird-ParkerAgar)的費(fèi)用。

7.通過(guò)本次實(shí)驗(yàn),我們感到使用美國(guó)3M公司生產(chǎn)的Petrifilm.RSAPlate培養(yǎng)基和法國(guó)生物-梅利埃公司生產(chǎn)的Baird-ParkerRPF.Agar培養(yǎng)基檢測(cè)中的金黃色葡萄球菌。可以比目前常規(guī)檢測(cè)方法時(shí)間可縮短一半。并可以明顯節(jié)省大量人力。這完全符合實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)的要求,尤其是對(duì)基層較簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室條件中,更顯其使用方便的優(yōu)越性。

實(shí)習(xí)總結(jié):通過(guò)這次嚴(yán)謹(jǐn)而生動(dòng)的實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí),為我們先前在教學(xué)中學(xué)習(xí)到的知道提供了一個(gè)實(shí)際的操作實(shí)施平臺(tái),也為今后在這方面檢驗(yàn)技術(shù)的工作起到了指引作用。在過(guò)去的學(xué)習(xí)中,我們并不了解具體的病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)的具體流程,注意事項(xiàng)等等非常關(guān)鍵和必須的防御手段。通過(guò)上學(xué)期生產(chǎn)實(shí)習(xí),使我們對(duì)以前所不熟知的問(wèn)題有了深入的認(rèn)識(shí),也對(duì)目前的情況有所思考和感悟。在我看來(lái),動(dòng)物檢疫人員在我國(guó)國(guó)民生活中起到了關(guān)鍵作用,民以食為天,沒(méi)有認(rèn)真負(fù)責(zé)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè),將給社會(huì)帶來(lái)巨大的飲食災(zāi)難,為此,我感到非常自豪和驕傲。在今后的工作學(xué)習(xí)中,我將一如既往的認(rèn)真下去,無(wú)愧自己的職責(zé)和稱號(hào)。

在此感謝我的院各級(jí)領(lǐng)導(dǎo),特別是我的指導(dǎo)老師趙宇軍教授。

201*年7月

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