Leica全自動(dòng)染色封片工作站的使用體會(huì)

Leica全自動(dòng)染色封片工作站的使用體會(huì)

隨著病理學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，全自動(dòng)染色封片一體化工作站以其卓越的性能和良好的處理效果，特別是其穩(wěn)定、高效的染色過程，逐漸被各大醫(yī)院和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室接受并使用，并逐步替代目前的人工染色。自將工作站應(yīng)用于常規(guī)HE染色以來，經(jīng)過近10萬(wàn)例的實(shí)際應(yīng)用，切片染色效率明顯提高，染色效果穩(wěn)定，染色質(zhì)量顯著改觀。1材料與方法1.1儀器設(shè)備

德國(guó)Leica","p":{"h":16.932,"w":37.603討論

傳統(tǒng)手工染色操作繁瑣，勞動(dòng)強(qiáng)度大，溫度、時(shí)間、試劑、環(huán)境、個(gè)體差異等因素皆可影響染色效果，不適合大批量標(biāo)本的染色處理。而全自動(dòng)組織切片染色機(jī)因其獨(dú)特的以人為本的智能化設(shè)計(jì)理念、周到而完善的處理程序，不但極大地保證了切片染色質(zhì)量的高效性、穩(wěn)定性，還可以減輕工作強(qiáng)度和改善工作環(huán)境。3.1優(yōu)點(diǎn)

3.1.1效率高可進(jìn)行批量標(biāo)本的染色，最多12個(gè)染色架同時(shí)染色，每個(gè)染色架裝30張切片，并可同時(shí)運(yùn)行多個(gè)程序，尤其適用于標(biāo)本量大的單位。與傳統(tǒng)手工染色相比，染色同時(shí)工作人員可進(jìn)行其他工作（如切片），工作時(shí)間統(tǒng)籌化，整體工作效率得以提高。

3.1.2穩(wěn)定性好染色封片工作站的各步驟均由單片機(jī)控制，時(shí)間控制精準(zhǔn)、嚴(yán)密。在程序設(shè)定合理的前提下，染色效果更穩(wěn)定[3]。有報(bào)道，室溫低于15℃時(shí)染色效果不佳，應(yīng)適當(dāng)提高室溫[2]。我科室日常工作中室溫始終保持在23℃左右，染色效果穩(wěn)定，無(wú)明顯差異�？稍O(shè)置數(shù)個(gè)精確步驟（如蘇木素、分化），當(dāng)相鄰染色架出現(xiàn)時(shí)間沖突時(shí)，優(yōu)先確保精確步驟染色。3.1.3保障具有斷電記憶功能，斷電重新啟動(dòng)后，可以繼續(xù)染色流程，不必從頭重復(fù)染色�？蛇x配UPS電源，在主電源缺乏時(shí)持續(xù)供電，保障染色工作繼續(xù)完成。

3.1.4安全工作站在相對(duì)密閉的空間中進(jìn)行染色封片，大大減少了有毒揮發(fā)性試劑（尤其是二甲苯）對(duì)工作環(huán)境及工作人員的危害。我科室將染色工作站放于通風(fēng)櫥中，更加有利于對(duì)環(huán)境和人員的保護(hù)。

3.1.5便于質(zhì)控自動(dòng)染色機(jī)調(diào)整好各步驟時(shí)間，可產(chǎn)生精確而連貫的染色、分化、脫水等過程，與傳統(tǒng)染色相比，受人為因素影響較��；同時(shí)可以限定各染色切片的數(shù)量，到達(dá)使用期限，機(jī)器會(huì)自動(dòng)報(bào)警提示，對(duì)常規(guī)染色的質(zhì)量控制提供了可靠平臺(tái)。3.2日常使用時(shí)的注意事項(xiàng)

3.2.1染缸的排列染缸中的液體盡量按照染色步驟依次排列，所有需要沖水的步驟都應(yīng)靠近水缸，并使機(jī)械臂行進(jìn)的路線時(shí)間最短化；機(jī)械臂前進(jìn)時(shí)有一定的回轉(zhuǎn)，合理設(shè)計(jì)避免玻片上的試劑滴入其他染缸造成污染；透明用二甲苯靠近染色機(jī)出口位置，便于將玻片快速轉(zhuǎn)入封片機(jī)進(jìn)行封片。

3.2.2試劑的使用與更換根據(jù)實(shí)際工作情況，我科使用成品Harris蘇木素染液（珠海貝索），染片約2500張；使用0.5%水溶性伊紅，滴加1～2滴冰醋酸促染，染片約","p":{"h":15.839,"w":15.84,"x":631.95,"y":451.768,"z":90},"ps":null,"t":"word",綜上所述，全自動(dòng)染色封片工作站操作簡(jiǎn)單方便，染色效率高效果好，改善工作環(huán)境。除應(yīng)用于常規(guī)HE染色外，在部分特殊染色和快速冰凍切片染色中也得到較好應(yīng)用，充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，更好促進(jìn)病理技術(shù)的發(fā)展。

擴(kuò)展閱讀：新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)在臨床工作中高標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用體會(huì)(1)

新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)在臨床工作中高標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用體會(huì)

馬鐵，紀(jì)蓮，姜衛(wèi)國(guó)

121

（1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院.病理科；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心動(dòng)物室，沈陽(yáng)110004）

摘要目的探討新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)在臨床病理工作中高標(biāo)準(zhǔn)化操作的應(yīng)用。方法選擇病理

工作中常用的ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種抗體，分別使用其即用型及濃縮型試劑，使用BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測(cè)）及新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果使用即用型一抗染色效果偏強(qiáng)，使用濃縮型一抗達(dá)到最佳染色效果，切片著色均勻，陽(yáng)性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰，無(wú)邊緣效應(yīng)，無(wú)非特異性著色。結(jié)論新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)染色全過程實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作簡(jiǎn)便規(guī)范，染色結(jié)果可靠，節(jié)約試劑成本，為臨床病理診斷提供有力依據(jù)。

關(guān)鍵詞全自動(dòng)；免疫組化；高標(biāo)準(zhǔn)化；染色

Researchonhighstandardizationofthenovelautomaticimmunohistochemistrystainerinclinicalpractice

AbstractObjectiveToexploretheapplicationofthenewautomaticimmunohistochemicalstainingmachineinclinicalpathologywithhigh-standard.MethodsMorethan30kindsofcommonantibodies(ER,PR,Ki-67,CD3,CD20,P504S,P63,CK,etal,includingimmediateandconcentratedtype,respectively)ischosentostainwithBondPolymerRefineDetection(polymerfinedetection)andthenewautomaticimmunohistochemicalstainingmachine.ResultsThedyeingeffectoftheimmediatetypeisstronger.Tousetheconcentratedcanachievethebestdyeingeffect,withcoloruniformity,accuratepositioningofpositiveresults,clearbackground,withoutedgeeffectandnon-specificcolor.ConclusionThenewautomaticimmunohistochemistrystainingmachineismechanizationduringthewholeprocess,highstandardizationdegree,simpleandnormativeoperation,reliabledyeingresults,reagentsaving

cost,canprovideastrongbasisforclinicalpathologydiagnosis.Keywords:

目前國(guó)內(nèi)多數(shù)醫(yī)院病理科使用自動(dòng)免疫組化染色機(jī)進(jìn)行免疫組化染色

［1］

。但多數(shù)自動(dòng)

免疫組化染色機(jī)未完全實(shí)現(xiàn)“全自動(dòng)”（如不能進(jìn)行脫蠟及抗原修復(fù)等），某些步驟還需要手工操作。此外，操作時(shí)還需用免疫組化筆對(duì)染色區(qū)域進(jìn)行劃定；若玻片清潔度不佳、染色架傾斜等，會(huì)出現(xiàn)染色不均現(xiàn)象

［2］

。這在不同程度上制約了免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展

［3］

。

我科室近年使用德國(guó)Leica公司生產(chǎn)的BOND-MAX型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，該染色機(jī)全過程實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作簡(jiǎn)便規(guī)范。筆者在使用過程中有如下體會(huì)。1.材料與方法

1.1材料用防脫載玻片常規(guī)制備3μm厚各種常用一抗陽(yáng)性對(duì)照切片若干張，經(jīng)62℃烤片2小時(shí)后備用（以下簡(jiǎn)稱待檢切片）。

1.2儀器設(shè)備德國(guó)Leica公司全自動(dòng)免疫組化染色操作儀，計(jì)算機(jī)，手持式ID掃描儀，玻片標(biāo)簽儀，Covertile（玻片蓋）。

1.3試劑ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種一抗，BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測(cè)），洗滌溶液，抗原修復(fù)液，脫蠟溶液。

1.4實(shí)驗(yàn)方法設(shè)立3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：即用型一抗試劑組、與即用型一抗試劑相對(duì)應(yīng)同種濃縮型一抗試劑組（以下簡(jiǎn)稱濃縮型一抗試劑組）、以及陰性對(duì)照組。使用新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)進(jìn)行免疫組化染色。

⑴即用型一抗試劑組：將待檢切片貼上標(biāo)簽放入染色機(jī)中，按染色機(jī)操作流程，結(jié)合一抗說明書要求設(shè)定是否進(jìn)行抗原修復(fù)、抗原修復(fù)液種類及修復(fù)時(shí)間，使用市售即用型一抗試劑對(duì)待檢切片進(jìn)行免疫組化染色，鏡檢，觀察結(jié)果。

⑵濃縮型一抗試劑組：用抗體稀釋液將常用濃縮型一抗試劑按說明書推薦效價(jià)進(jìn)行倍比稀釋，按染色機(jī)操作流程使用倍比稀釋后的一抗對(duì)待檢切片進(jìn)行免疫組化染色，直至一抗倍比稀釋后的濃度染色出現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性結(jié)果，鏡檢，觀察結(jié)果。

⑶陰性對(duì)照組：用PBS緩沖液代替一抗，按染色機(jī)操作流程對(duì)任意待檢切片進(jìn)行免疫組化染色，鏡檢，觀察結(jié)果。

1.5染色機(jī)操作流程⑴啟動(dòng)Bond軟件，進(jìn)入Bond操作系統(tǒng)。⑵輸入病例詳細(xì)信息：包

括病理號(hào)、試劑滴加容量、制備操作規(guī)程、玻片詳細(xì)信息（是否烤片、脫蠟等）、抗原修復(fù)方式

［4、5］

等。⑶經(jīng)玻片標(biāo)簽儀打印標(biāo)簽，將標(biāo)簽貼在待檢組織切片磨砂側(cè)。⑷待檢組織切

片放入玻片架凹槽內(nèi)。⑸Covertile（玻片蓋）覆蓋于切片表面。⑹玻片架放入染色機(jī)中。⑺各種一抗按各自效價(jià)稀釋好裝進(jìn)試劑瓶?jī)?nèi)，放入染色機(jī)中。⑻BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測(cè)）放入染色機(jī)中。⑼檢查洗滌溶液、抗原修復(fù)液、脫蠟溶液、酒精等大容量試劑瓶中試劑量是否充足。⑽一切準(zhǔn)備就緒，儀器開始運(yùn)行，直至蘇木精復(fù)染結(jié)束。⑾取下切片，經(jīng)脫水、透明、中性樹膠封固。2結(jié)果

經(jīng)全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)進(jìn)行免疫組化染色標(biāo)記，即用型一抗試劑組ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種切片染色效果均偏強(qiáng)，陽(yáng)性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景較清晰（如圖1）；

濃縮型一抗試劑組在說明書推薦效價(jià)內(nèi)的ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種一抗?jié)舛惹衅�染色效果亦均偏�?qiáng)，陽(yáng)性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景較清晰；而達(dá)到最佳染色效果切片的一抗?jié)舛染�高于說明書推薦效價(jià)，切片著色均勻，陽(yáng)性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰，無(wú)邊緣效應(yīng)，無(wú)非特異性著色（如圖2）；

陰性對(duì)照組切片無(wú)DAB著色，細(xì)胞核藍(lán)染，背景清晰。

圖1乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，PR細(xì)胞核陽(yáng)

性，一抗選用市售即用型抗體，細(xì)胞核大部分棕黃色，濃染，局灶間質(zhì)纖維細(xì)胞著色200×

圖2乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，PR細(xì)胞核陽(yáng)

性，一抗選用濃縮型抗體1:4000倍稀釋，細(xì)胞核大部分棕黃色，著色均勻，定位準(zhǔn)確，背景清晰200×

3體會(huì)

近年來，病理學(xué)界大力倡導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制，在新抗體、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)的今天，免疫組化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化不僅為疾病的診斷提供有力幫助，對(duì)臨床治療也發(fā)揮越來越多的指導(dǎo)作用。新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)是病理科實(shí)現(xiàn)高標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的便捷而可靠的工具。

⑴全程實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。該染色機(jī)有玻片加熱功能，切片后可直接進(jìn)行烤片、脫蠟、抗原修復(fù)等工作，各步驟溫度、時(shí)間恒定；抗原修復(fù)時(shí)可根據(jù)一抗修復(fù)要求，選用不同抗原修復(fù)液，而且多張切片不同修復(fù)方法可同時(shí)進(jìn)行，避免手工操作易造成混亂。

⑵操作簡(jiǎn)便，完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。只需將貼好標(biāo)簽的切片及所需試劑放入染色機(jī)中，點(diǎn)擊開始按鈕，機(jī)器便會(huì)根據(jù)標(biāo)簽信息自動(dòng)完成免疫組化染色全過程（包括烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、抗體滴加、蘇木精復(fù)染等），整個(gè)流程完全不需要病理技術(shù)人員手工干預(yù)，既使不同的工作人員進(jìn)行操作也不會(huì)出現(xiàn)染色結(jié)果的波動(dòng)；但操作時(shí)應(yīng)注意將相同操作程序的切片放入同一玻片架（如有的切片需進(jìn)行烤片，有的切片不需進(jìn)行烤片應(yīng)分別放于不同的玻片架）。

⑶BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測(cè)）靈敏度較高，使用市售即用型一抗染色效果偏強(qiáng)，必須稀釋一定倍數(shù)后使用，因同種不同批次即用型一抗試劑售出時(shí)稀釋濃度不盡相同，故每次更換一抗均需對(duì)新抗體和檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行最佳實(shí)驗(yàn)條件的預(yù)試驗(yàn)，以確定一抗最佳稀釋濃度，這無(wú)形中增加技術(shù)人員的工作量，同時(shí)也造成檢測(cè)系統(tǒng)試劑浪費(fèi)。筆者在大量工作中不斷摸索，反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)如使用濃縮型一抗，可較好解決此問題。只需在第一次購(gòu)入時(shí)對(duì)抗體和檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行最佳實(shí)驗(yàn)條件的預(yù)試驗(yàn)，確定一抗最佳稀釋濃度，消耗殆盡時(shí)再訂購(gòu)?fù)�一試劑廠家產(chǎn)品，按上次預(yù)試驗(yàn)確定的稀釋濃度稀釋即可。而且在實(shí)際工作中一抗最佳稀釋度往往高于試劑說明書建議稀釋度（如PR抗體，試劑說明書建議稀釋濃度為1:100～1:200，但筆者經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳稀釋度為1:4000），大大節(jié)約了訂購(gòu)一抗試劑的成本。但值得注意的是每次不可配置過多，應(yīng)少配勤配，防止使用時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致效價(jià)下降，影響染色結(jié)果。

⑷采用獨(dú)特設(shè)計(jì)Covertile（玻片蓋），可使試劑均勻覆蓋于組織表面，避免染色過程中干片，使組織染色均勻一致，而且省去多數(shù)免疫組化染色機(jī)用免疫組化筆劃定試劑加入范圍的過程，省時(shí)省力；但玻片架送入染色機(jī)時(shí)不可用力過大，否則易造成Covertile（玻片蓋）錯(cuò)位，導(dǎo)致試劑不能正常加入。Covertile（玻片蓋）使用后表面會(huì)有DAB殘留物附著，可用新配制的“健之素牌消毒片”（其有效成份為三氯異氰尿酸）浸泡2-4小時(shí)，然后用流水沖洗，再用70%乙醇浸泡2分鐘，或用蒸餾水洗三次，每次3分鐘，晾干備用。筆者發(fā)現(xiàn)若用流水沖洗后直接晾干，易產(chǎn)生水漬；若用100%乙醇浸泡，易導(dǎo)致Covertile（玻片蓋）出現(xiàn)裂紋，影響染色效果。

⑸染色機(jī)上有水平指示裝置，可隨時(shí)觀察染色機(jī)水平狀態(tài)，從而防止因?qū)嶒?yàn)臺(tái)面傾斜而導(dǎo)致切片染色不均。

⑹洗滌溶液、抗原修復(fù)液、脫蠟溶液、酒精等大容量試劑瓶中無(wú)液面感應(yīng)裝置，每次運(yùn)

行前均需對(duì)這些試劑容量進(jìn)行檢查，確保充足后，再進(jìn)行染色。

⑺此機(jī)廢液采用有害和無(wú)害分瓶處理方式，有害廢液可集中統(tǒng)一處理，避免對(duì)周圍環(huán)境造成污染，有利于環(huán)保健康。

綜上所述，按照國(guó)際免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化的要求，在病理實(shí)驗(yàn)室中成功開展免疫組織化學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)化。新型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)真正實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)操作，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作方便，而且染色結(jié)果可靠，背景清晰，重復(fù)性好。但全自動(dòng)染色機(jī)也不是萬(wàn)無(wú)一失的，要做好每一張免疫組化切片，除了要注意以上事宜，還要求病理技術(shù)人員具有高度的責(zé)任感和精益求精的工作作風(fēng)，需經(jīng)常檢查設(shè)備運(yùn)行狀況，注意染色操作中的各個(gè)細(xì)節(jié)，每次染色后均要進(jìn)行染色結(jié)果“初審”，在顯微鏡下觀察是否定位準(zhǔn)確，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)調(diào)整和解決，這樣才能為病理診斷提供可靠的依據(jù)。參考文獻(xiàn)：

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具體修改意見見文中，修改后發(fā)表。

補(bǔ)充作者簡(jiǎn)介：內(nèi)容包括作者姓名（出生年），性別，籍貫，職稱，學(xué)位，主要研究方向。補(bǔ)充英文關(guān)鍵詞，需與中文相對(duì)應(yīng)。參考文獻(xiàn)4補(bǔ)充頁(yè)碼。

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